發布:2023-09-18 09:53:00編輯:視頻君來源:視頻教程網
以下是根據NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細胞培養protocol整理而成。根據經驗作部分修改。
1、一般培養-保持胚胎干細胞處于未分化狀態
培養基
細胞復蘇
凍存細胞
明膠包被
細胞傳代
2 、體外分化
培養基
包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養板(使用或不使用蓋玻片)
體外分化方法
注:以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系,其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol,需要用專用的protocol和培養基。
一般培養——維持ES細胞處于未分化狀態
ES細胞培養用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed細胞的培養基(高糖)來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2-3天從達到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細胞一次,細胞傳代以后,在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養皿之前,通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養板2個小時,使分化細胞粘附,從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃,5%CO2,100%濕度條件下培養。如果在Feed細胞,那么就需要采用MMC進行處理,抑制Feed細胞增殖,但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。
培養基
ES:
配制一20×不含DMEM,HS,LIF的溶液(該溶液也能用于EB培養基——見下文)。分裝在50ml 離心管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。通過將21ml該溶液,HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基,0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃,時間不要超過2周。
貯存液
DMEM(高糖)
馬血清(HS)
L-谷氨酰胺(200mM)
MEM NEAA(10mM)
HEPES(1M)
β-巰基乙醇(55Mm)
PEST
LIF
復蘇細胞
細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結晶的形成,結晶的形成會損害細胞。然而,二甲基亞砜對細胞有毒性,快速的進行細胞復蘇是很重要的。
步驟:
1.從液氮中取出一管細胞;
2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內溶液恰好完全溶解);
3.將細胞轉移到一15ml Falcon管中;
4.加入5ml ES培養基(用培養基沖洗凍存管);
5.離心3分鐘;
6.棄上清,用2ml ES培養基重懸細胞,至少吹打10次;
7.接種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm組織培養皿;
8.孵育。
做實驗之所以常用小白鼠,主要有以下幾個原因:
第一:老鼠中的小白鼠的基因序列和人類的差不多,它的全基因組和人類的相似度極高,很多人類難以治愈的疾病可以在小白鼠身上找到相似性狀,從而加以實驗發現治病基因。
第二:實驗專用白鼠的生物學意義較大,培育出的小鼠幾乎完全沒有個體差異(生理上)。生理上沒有個體差異是否意味著氣質上沒有差異尚不明了,不過選擇純系實驗白鼠主要還是為了盡可能的減少先天的個體差異。
第三:數量充足,許多實驗需要統計學分析,這就要求一定的數量,大白鼠和小白鼠,特別是小白鼠,在人工繁殖條件下,能滿足這一要求。還有動物等級,小白鼠好歹也是哺乳動物,除了體形小,與其它哺乳動物的進化水平相比并不差。體形小反而成為人工繁殖喂養的有利條件。
第四:其實很多實驗用猩猩等與人更近似的動物做最好,但使用猩猩太昂貴了。許多實驗,比如認知類的,實驗結束后時需要將動物殺死,來檢查其內部變化的。這樣,大量的實驗肯定就不能用比較“貴重”的猩猩了。
第五:由于這種大型的哺乳動物受到動物保護協會的保護。那么多不“人道”的實驗也就受到限制了。即使用的是小白鼠,動協的人仍然有抗議呢。
第六:一些實驗用不著那些大型的,復雜的動物來做。